TwistAmp®Liquid:一种取代PCR的多功能的扩增方法

在这里，我们介绍TwistAmp®液体，一种新的PCR替代形式，使RPA技术更适用于广泛的研究应用。与PCR扩增相比，RPA只需几分钟，而不是几个小时，可以运行不需要额外设备。TwistAmp®Liquid Basic和Basic试剂盒可用于需要良好保真度，凝胶电泳或固相检测的应用。TwistAmp®Liquid exo和exo允许快速实时扩增和检测目标而不牺牲灵敏度或特异性。

概述

      图1:RPA循环，重组酶蛋白与引物形成重组丝，并将其插入DNA双螺旋的互补位点，形成d环。单链dna结合(SSB)蛋白稳定双螺旋结构和d环的开放。重组酶的分解允许链置换聚合酶沿着目标序列延伸引物的3端。当对相反的引物重复这个序列时，指数扩增发生而不需要热变性或退火。

      自2008年推出以来，TwistAmp®试剂盒为科学家提供了一种简单的方法来进行重组酶聚合酶扩增(RPA)，迄今为止已有250多篇关于该技术的同行评审出版物。RPA是一种等温替代聚合酶链反应(PCR)的方法，它使用三种蛋白质(重组酶，单链dna结合蛋白和链置换聚合酶)来代替热循环(图1)。RPA在恒定低温下(理想情况下为37-42°C)效果，反应速度非常快(反应时间小于20分钟)，可以用稳定的冻干颗粒启动，这使得它非常适合即时测试。此外，RPA用户已经在各种不同的应用中测试了TwistAmp®试剂盒试剂，包括那些传统上使用PCR的试剂(如最近对RPA应用的回顾所述1)。与PCR一样，简单的RPA使用两种相反的引物以指数方式扩增DNA的特定区域。RPA引物对遵循与PCR引物相似的设计规则，并且为PCR反应开发的引物通常在RPA反应中表现良好。

关于TwistAmp®Liquid试剂盒

     为了鼓励这种多为了鼓励这种多用途的RPA技术，TwistDx™开发并推出了TwistAmp®液体试剂盒，为用户提供更灵活的试剂。TwistAmp®Liquid试剂盒类似于在每个分子生物学实验室冷冻室中发现的预制PCR master mixes，包括核心RPA蛋白混合物的甘油储存管，一管缓冲液，一管驱动重组过程所需的能量混合物和一管用于蛋白质的醋酸镁辅助因子。

      有四种TwistAmp®液体试剂盒可用:基本和基本RT扩增无探针，适用于凝胶电泳，固相扩增和微阵列应用与尾部引物和适配体;exo和exo RT，它们与基于探针的实时检测方法兼容。所有四个试剂盒包含相同的核心反应混合物，重组酶，单链结合蛋白和链置换聚合酶的比例与冻干的TwistAmp®基本试剂盒相同。因此，当使用液体试剂盒时，使用冻干的TwistAmp®基本试剂盒进行的分析当然应该表现得非常相似，但使用其他冻干的TwistAmp®试剂盒进行的分析在使用液体试剂盒时可能会显示出不同的分析性能。图2显示：使用TwistAmp®exo RT和TwistAmp®Liquid exo RT进行的检测均检测到50份人呼吸道合胞病毒B RNA模板。除了Core Reaction Mix外，exo试剂盒还包含一管外切酶III，用于处理TwistAmp®外切酶探针进行实时荧光检测，RT试剂盒包含一管逆转录酶，用于将RNA单步转化为cDNA并随后扩增。

     TwistAmp®液体试剂盒，类似于他们的冻干对应试剂盒，配制允许扩增片段高达500个碱基对的大小，这足以用于许多常见的PCR实验室用途(不同的蛋白质制剂正在开发，以允许更长的扩增子)。这使得RPA成为许多标准实验室克隆和测序方案中取代PCR的优秀候选者。当用于Illumina下一代测序文库制备时，RPA比校对聚合酶(如Kapa HiFi和Platinum pfx2)导致的错误更少。此外，在为合成生物学开发的端到端自动化微流控平台上，利用Gibson克隆的等温变体，RPA已被用于生成更长的754碱基对片段，从而证明了在已建立的聚焦pcr方案中成功实施RPA。

TwistAmp®Liquid试剂盒优势

      与冻干的TwistAmp®试剂盒相比，TwistAmp®Liquid的一个关键优势是，科学家可以根据需要使用尽可能多或尽可能少的TwistAmp®试剂，在他们选择的容器中进行反应。与PCR不同的是，RPA是等温的，在相对较低的最佳温度下工作，并且可以耐受过低温度和温度波动。在将主混合物输送到反应体系之前不需要预热，并且在较低的等温温度下，蒸发和冷凝的影响不是主要问题。这意味着在小的、分区的微流体装置体积中的热控制得到了简化:RPA已被证明可以在非常小的(皮升)体积中工作4。RPA的这些属性也意味着它可以用于比PCR理想的更大体积的反应。图3显示：一对PCR引物5成功扩增了淋病奈瑟菌269碱基对片段，反应量为2.5 ~ 5000微升。因此，TwistAmp®液体反应可以在从定制的微流体装置到标准实验室96孔板到微离心管，甚至更大的容器中运行。

选择TwistAmp®液体试剂盒而不是冻干TwistAmp®试剂盒的科学家有更多的选择性，因为TwistAmp®液体试剂盒不包括脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)。因此，可以用三磷酸脱氧尿苷(dUTP)或标记的核苷酸进行检测，以允许扩增子捕获或比色或电化学检测6 - 8。

总结

RPA已在250多项外部研究中得到应用，并在众多应用和领域中越来越具有优势。我们的新型TwistAmp®液体是实验室分子生物学研究中第一个可行的PCR替代品。

1. Lobato, I.M. & O’Sullivan, C.K. Trends Analyt. Chem. 98, 19–35 (2018).

2. Oyola, S.O. et al. BMC Genomics 13, 1 (2012).

3. Linshiz, G. et al. J. Biol. Eng. 10, 3 (2016).

4. Li, Z. et al. PLoS One 11, e0153359 (2016).

5. Sachdev, D., Patel, A.L., Sonkar, S.C., Kumari, I. & Saluja, D. Biomed Res. Int. 2015,

597432 (2015).

6. Koo, K.M., Wee, E.J. & Trau, M. Theranostics 6, 1415–1424 (2016).

7. Wee, E.J., Ngo, T.H. & Trau, M. Clin. Epigenetics 7, 65 (2015).

8. Lau, H.Y. et al. Sci. Rep. 7, 38896 (2017). 

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