内切酶的酶切出现问题，先看内切酶说明书，相应试剂公司目录。不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，酶切效果也有差别。可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系、酶切反应温度、酶是否受甲基化影响等。
1.质粒问题
制备不当的DNA样品、纯度差或残留酶切污染（抑制物）。杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、乙醇、蛋白质、EDTA、SDS、高盐等。
A260/A280是在测量DNA、RNA提纯后的纯度的，如果有蛋白质污染，这个比值就比较小。因为蛋白质在280处有吸收值。高纯度的DNA、RNA这个比值应该在1.8-2左右。
2.酶的问题
确认内切酶有效（很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。确认酶切效果不好，做标记，更换）。
3.buffer问题
有些酶切的buffer中，添加了一些较为容易析出或溶解的成分，有时酶切的buffer没有*融化时，buffer的浓度是不均一的。新的buffer先融化的部分，盐离子浓度要高，使用一段时间后，融化部分的离子浓度会变低。通常，这种影响不大，但如果是使用一些对离子浓度敏感的内切酶时就会出现问题。
4.双酶切的buffer选择
确认使用的是正确的buffer和反应温度。
5.酶切位点的甲基化影响
限制性内切酶不能切割甲基化的识别序列。常见的有Xba I、Bcl I等。甲基化主要分为Dam、Dcm和CpG甲基化等。大肠杆菌等原核生物具有限制－修饰系统，Dam、Dcm常使DNA样品甲基化而不被切割。如果是直接从哺乳动物细胞中提取的DNA，则部分DNA会因CG methylase的影响而被甲基化。一些酶切位点被甲基化后，酶切会受影响。因此，出现酶切不开或不全时需要考虑甲基化的问题。
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